В окрестностях небольшого города Раккун-Сити недавно начали происходить чудовищные убийства. В полицейских рапортах указывалось, что нападения совершались группами примерно из 10 человек, а жертвы были как будто съедены. Полиции не удалось найти убийц, и тогда к делу привлекли специальный отряд «S.T.A.R.S.» (Special Tactics And Rescue Service — Спецотряд по Тактическим и Спасательным Операциям), разбитый на команды «Альфа» и «Браво».

Сначала на расследование отправляется команда «Браво», с которой вскоре теряется связь. После этого на их поиски посылают команду «Альфа». Во время облета местности, где с командой «Браво» была потеряна связь, бойцы команды «Альфы» замечают столб дыма, исходящий с земли, и принимают решение высадиться. После высадки члены отряда осторожно осматривают территорию. Выясняется, что дым шел от вертолета команды «Браво», однако найти самих членов команды им не удается, что также странно, в вертолете лежит их нетронутое снаряжение. Команда «Альфа» начинает прочёсывать местность. Всё идет нормально, пока вдруг член команды Джозеф Фрост не находит в траве пистолет. Подняв его, он вскрикивает, заметив, что рукоятку до сих пор сжимает чья-то оторванная рука. Внезапно из ниоткуда на него набрасываются ужасающего вида собаки. Джозеф оказывается застигнутым врасплох, другие члены команды тоже не успевают среагировать. Он пытается отбиться от собак, но силы неравны, и он погибает ужасной смертью прямо на глазах у товарищей. Остальным бойцам удаётся уничтожить тварей. В это время пилот команды «Альфы» Брэд Викерс, услышав выстрелы, теряет самообладание и улетает, бросив команду. Видя улетающий вертолет, бойцы теряются, однако вскоре неподалеку раздается рычание собак. Решив, что Джозефу уже не помочь, они спасаются бегством, на бегу отстреливаясь от тварей. Вскоре они замечают какой-то особняк и направляются туда. Дверь оказывается не запертой…

Отряд «Альфа»:
Джилл Валентайн — главная героиня игры. Является мастером в области использования отмычек. Проживает в городе Ракун. По характеру добрая и отзывчивая девушка с обостренным чувством справедливости.
Крис Редфилд — главный герой игры. Бывший пилот ВВС, которого привел в «S.T.A.R.S» его друг Бэрри Бертон. В отряде поддерживает репутацию лучшего стрелка и надежного друга.
Альберт Вескер — является лидером отряда «S.T.A.R.S», который пользуется большим уважением у всей команды. По ходу сюжета игрок сможет узнать больше о причастности Вескера к инциденту в Арклейских Лесах и о его связи непосредственно с Т-вирусом. Почти в конце игры его "убивает" Тиран.
Бэрри Бёртон — бывший член спецназа, который занимает в команде «S.T.A.R.S.» должность специалиста по оружию. Является товарищем Криса Редфилда. Единственное слабое место Бэрри — его семья.
Джозеф Фрост — является специалистом по транспортным средствам. После высадки «Альфы», Джозеф становится первой потерей команды — его загрызают церберы.
Брэд Викерс — компьютерный эксперт, отвечающий за сбор информации. В команде также выполняет роль квалифицированного пилота. В «S.T.A.R.S» Брэд получил прозвище «Цыплячье Сердце» за свою трусость и постоянный страх перед опасностью. К концу игры он скидывает Ракетницу для последнего боя с Тираном.

Отряд «Браво»:
Ребекка Чамберс — самый молодой член команды. Должность — медик. Несмотря на свой юный возраст, обладает достаточной храбростью и опытом, являясь единственной выжившей из отряда «Браво».
Энрико Марини — лидер команды, его можно назвать вторым человеком в «S.T.A.R.S» после Альберта Вескера. Обладает огромным опытом ведения боевых действий и воинским бесстрашием. Энрико становится жертвой предательства внутри отряда, когда его убивает Вескер..
Форест Спейер — является одновременно и снайпером и специалистом по транспорту. Заклёван до смерти мутировавшими воронами.
Кеннет Джей Салливан — является экспертом—химиком. Пришёл в отряд по рекомендации Альберта Вескера. Был убит зомби.
Ричард Эйкен — будучи единственным профессиональным связистом, занимает одну из самых важных должностей в «S.T.A.R.S.». В ходе игры погибает от укуса гигантской змеи.

События происходят через 2 месяца после инцидента в Арклейских лесах. Т-вирус был модифицирован учёным, работающим на корпорацию «Umbrella» — Уильямом Биркином, одним из создателей Т-вируса. Ученый работал в секретной подземной лаборатории в Ракун-Сити. Модифицированный вариант, названный G-вирусом был необходим корпорации, и «Umbrella» присылает за вирусом свой спецназ. Из-за произошедшего инцидента между Уильямом Биркином и солдатами, образцы G- и Т-вирусов были разлиты в канализации, рядом с которой находилась секретная лаборатория, и канализационные крысы разнесли вирус по всему городу. Началось массовое заражение.

Одновременно в город прибывают Леон Скотт Кеннеди (являющийся главным героем Resident Evil 4), только что назначенный на работу в полицейском департаменте Ракун-Сити (R.P.D.), и Клэр Редфилд, приехавшая на поиски своего брата Криса Редфилда, участвовавшего в инциденте в Арклейских горах и являвшегося одним из главных героев первой части «Resident Evil». Герои встречаются в начальном видеоролике, но тут же разделяются. Позже они ещё несколько раз пересекаются по сюжету, но в основном перемещаются в одиночку до самого конца игры.

Леон Скотт Кеннеди - полицейский, в первый день службы приехавший в Раккун-сити.
Клэр Рэдфилд - сестра Криса Рэдфилда, главного героя Resident Evil, приехала в город на поиски своего брата.
Эйда Вонг - агент неизвестной корпорации, нанятый с целью получению G-вируса. Она быстро входит в доверие к Леону. Едва не погибает ближе к концу игры, однако таинственным образом спасается.
Шерри Биркин - дочь Уильяма и Аннет Биркин, в её медальоне спрятан образец G-вируса. Вместе с Леоном и Клэр она спасается и бежит из города.
Уильям Биркин - разработчик нового G-вируса, модифицированного варианта оригинального Т-вируса. Его расстреливает отряд Ханка, но он успевает вколоть себе G-Вирус и мутирует. Главный враг в игре.
Аннет Биркин - жена Уильяма Биркина, погибает в конце игры.
Марвин Бренег - полицейский. Он успевает передать Леону карточку доступа к компьютеру, управляющему электронными замками на дверях в полицейском участке. При второй встрече Марвин превращается в зомби. Также его можно увидеть в «Resident Evil 3», он, смертельно раненый, лежит без сознания. В Resident Evil: Outbreak file #2 играет значительную роль в эпизоде Desperate Times.
Брайан Айронс - шеф полиции Раккун-Сити. Сходит с ума. Погибает от рук Биркина в середине игры.
Бен Бертолуччи - репортёр, сидящий в тюрьме за преступление, которого не совершал. Погибает от разрыва грудной клетки паразитом, который был насильственно впущен в его тело мутировавшим Уильямом Биркином.
Роберто Кендо - владелец оружейного магазина Кендо. Его убивают зомби в самом начале игры.
Ханк - имеет также прозвище «Мистер Смерть», офицер специальных сил корпорации «Umbrella» «U.S.F.U.», которого корпорация направила в Раккун-Сити с целью изъятия образца G-вируса. Ханк не только выполняет эту миссию, но и остаётся в живых. Является главным героем секретного сценария «The 4th Survivor».
Брэд Викерс - пилот вертолёта из первой части игры. Превратился в зомби. Его можно встретить под входом в полицейский участок на уровне сложности "Hard", если в самом начале игры дойти до полицейского участка, не подняв ни одного предмета. Так же его можно увидеть в Resident Evil 3: Nemesis. Брэда убивает Немезис.
Крис Рэдфилд - брат Клэр Рэдфилд. Появляется только в режиме «Extreme Battle».

Главной героиней в прототипе вместо Клэр Редфилд являлась некая Эльза Уокер (Elza Walker), приехавшая в Ракун-Сити для поступления в университет и создания своей собственной гоночной команды.
Работница корпорации «Umbrella» Линда (Linda), позже заменённая на Аду Вонг, также «путешествовала» по Ракун-Сити вместе с Леоном Кеннеди. В конце игры, в зависимости от действий игрока, она либо выживает, либо погибает.
Офицер полиции Марвин Бренег в прототипе играл более важную роль, чем в окончательной версии «Resident Evil 2». В какой-то момент за него даже можно было играть. В конце игры Бренег погибает от полученных ранений.
Шеф полиции Брайн Айронс в прототипе был положительным персонажем. В середине игры он погибает от укуса зомби.
Некий Джон (John), позже заменённый на Роберто Кендо, присутствовал в сценарии Эльзы. Его судьба зависит от действий игрока.
Офицер полиции Рой (Roy), которого не было в окончательной версии игры, по некоторым данным, был смертельно ранен в схватке с зомби и погибал в середине игры.
Журналиста Бена Бертолуччи в прототипе не было, хотя уже тогда этот персонаж был задуман.

Такие персонажи, как Леон Кеннеди, Шерри, Аннетт и Уильям Биркины присутствовали в прототипе и играли там те же роли, что и в окончательной версии игры.

Игра разделена на две части. Первая часть происходит за день, вторая — через день после событий «Resident Evil 2». Джилл Валентайн вернулась из особняка. На этом и закончилась первая часть «Resident Evil». Из-за того, что у одного члена U.S.F.U. который был под руководством Ханка, не выдержали нервы и вместо того чтобы отобрать у Вильяма Биркина колбу с T- и G-вирусами, он открыл по нему огонь, а вирусы упали в коллектор, и крысы разнесли его по городу, мирные жители Раккун Сити превратились в зомби. Многие члены «S.T.A.R.S.» к тому времени, как вирус добрался до города, уже были в Европе, чтобы уничтожить штаб-квартиру корпорации «Umbrella». Но Джилл не смогла (не захотела) поехать в Европу и именно ей предстоит бороться с этим злом в одиночестве, хотя на пути ей и будут попадаться союзники, всё равно это её борьба, и это её последний шанс — The Last Escape… Однако на ее пути будет стоять модель Тирана «Nemesis T-02», созданная чтобы уничтожить S.T.A.R.S. В 2004 году сюжетная линия игры была взята за основу фильма «Обитель Зла 2: Апокалипсис» («Resident Evil 2: Apocalypse»)

Джилл Валентайн (Jill Valentine) — член команды «Alpha» боевого отряда «S.T.A.R.S.», главная героиня игры.
Карлос Оливера (Carlos Olivera) — наёмник, член боевой команды «U.B.C.S.», он был послан в Ракун-Сити для спасения людей, однако сам попал в ловушку. Один из главных героев.
Брэд Викерс — член команды Alpha боевого отряда S.T.A.R.S., второй член «S.T.A.R.S.», оставшийся в городе. В начале игры его убивает Немезис.
Михаил Викторович (Michail Viktor) — русский наёмник, член боевой команды «U.B.C.S.». Храбрый солдат и верный товарищ. В середине игры он жертвует жизнью, чтобы спасти товарищей от Nemesis’а. Взрывает себя гранатой вместе с Nemesis'ом
Николай Зиновьев (Nicholai Zinoviev) — русский наёмник, член боевой команды «U.B.C.S.». Его задача — уничтожить всех свидетелей того, что причиной катастрофы в Ракун-Сити стала «Umbrella». В конце игры он пытается убить Джилл в лаборатории Амбреллы. В зависимости от того, какой life-choice вы сделаете, встретив Nemesis’a на мосту, Николай либо будет убит этим монстром рядом с утилизатором (если столкнуть Немесиса с моста), либо встретит Вас на вертолете рядом с вышкой (если Вы сами спрыгнете с моста). В этом случае, Вы можете либо дать негодяю спокойно улететь, либо обстрелять его вертолет.
Мерфи Сикер (Murphy Sicker) — член боевой команды «U.B.C.S.». Смертельно раненного, его убивает либо Карлос, либо Николай.
Тайрелл Патрик (Tirell Patrick) — член боевой команды «U.B.C.S.». Есть два варианта его смерти: либо он взрывается в госпитале, либо его убивает Николай Зиновьев.(При хорошей концовке — кончает жизнь самоубийством. Взрывает себя, чтобы убить Николая.)
Марвин Бренег (Marvin Branagh) — полицейский из «Resident Evil 2». Он лежит мёртвый в полицейском участке.
Дарио Россо (Dario Rosso) — встречается в начале игры. Он потерял свою дочь и из-за этого он практически сошёл с ума. Отказывает в помощи Джилл и запирается в контейнере на складе. Однако это ему не помогает — его убивают зомби. Если потом вернуться на склад, то можно увидеть Дарио мертвым, а также прочитать его дневник. Кстати в этом контейнере лежат очень полезные вещи!
Барри Бертон (Barry Berton) — член команды «Alfa» отряда «S.T.A.R.S.». Если, встретив Немесиса на мосту перед заводом, Вы не столкнете его в воду, Барри прилетит на вертолете и заберет Вас и Карлоса.

Вступительный ролик показывает как Клэр Рэдфилд проникает в здание корпорации "Umbrella" расположенное в Париже. С первых же кадров становится видно, что Клэр серьёзно изменилась с тех пор, как произошли печально известные события, положившие конец городу Раккун. Теперь Клэр напоминает настоящего суперагента, вот только несмотря ни на что, её захватывают в плен и отвозят на военную базу на затерянный в океане остров Рокфорт.

Совсем скоро после прибытия, охранник тюремного блока по имени Родриго Хуан Раваль открывает дверь в камеру Клэр и говорит, что она свободна, потому что на острове произошло массовое заражение людей Т-вирусом и теперь уже всё равно она вряд ли выживет. Большая часть военных успела покинуть остров, и теперь выживших и не заражённых людей на острове нет.

Пытаясь найти способ убраться с острова, Клэр объединяется с местным жителем, молодым человеком по имени Стив Бёрнсайд. Главным противником в этом для них становится командующий Альберт Эшфорд, полноправный владелец корпорации "Umbrella". Этот не вполне нормальный человек доставит Клэр массу неприятностей. Другой злодей, известный по предыдущим частям Resident Evil Альберт Вескер, виновный в распространении T-вируса на острове, задался целью заполучить образец уникального вируса T-Вероника, который создала сестра-близнец Альфреда Эшфорда Алексия.

Клэр и Стив находят самолёт и, преодолев массу трудностей, улетают. Однако Альфред дистанционно активирует автопилот, и самолёт берёт курс к берегам Антарктики, на другую базу корпорации. Туда же направляется и сам Альфред. На новой базе в криологической капсуле содержится его сестра-близнец Алексия, в тело которой 15 лет назад был введён вирус Т-Вероника. Альфред решает, что настало время для её высвобождения...

Битва с Альфредом на полузамёрзшей полярной станции тяжело ранит Альфреда, и герои ускользают на вездеходе. А Альфред пробуждает сестсру и это становится последним, что он видел в своей жизни. Алексия немедленно демонстрирует свои мощь и превосходство, вездеход настигают гиганские щупальца и это не позволяет героям бежать.

На время события вновь переносятся на остров Рокфорт. Получив от Клэр просьбу о помощи через Леона, Крис прибывает на остров. От охранника Раваля он узнаёт, что его сестра давно покинула остров. Крис встречается с Вескером, который давно хотел покончить с Крисом. Вескер имеет ряд суперспособностей, который ему придаёт наличие в его теле вируса, однако тут смеясь появляется могущественная Алексия и Вескер предпочитает бежать.

Последним в Антарктику прибывает Крис, и там он наконец находит Клэр, которая ищет пропавшего Стива. Когда же она его находит, то оказывается, что над ним был проведён печальный эксперимент — Алексия ввела ему Т-Веронику. Стив превращается в страшного монстра и пытается убить Клэр. В это время к Клэр опять подбираются щупальца Алексии, но тут Стив защищает Клэр, и погибает, сражённый Алексией.

Другая драма происходит в это же время в другом месте, где Крис и Вескер встречаются с Алексией. Вескер предпочитает бежать, оставляя Крису сражаться против Алексии. Одержав временную победу, Крис активирует систему самоуничтожения, чтобы открылись все двери и Клэр освободилась из тюремной камеры, где содержался Стив. Тут он окончательно уничтожает Алексию. Крис бежит к аварийному лифту и видит промелькнувшую тень Вескера, который завладел образцом Т-Вероники. Клэр ждёт своего брата в самолёте, пока он сражается с Вескером. Вескер одолевает Криса, но тут их разделяет взрыв, и Вескер удаляется, отложив выяснение отношений со Крисом на другой раз. Крис и Клэр покидают базу перед взрывом. Крис даёт клятву уничтожить корпорацию "Umberlla" раз и навсегда.

23 июля 1998 года, команда "Браво" спецотряда «S.T.A.R.S.» (Special Tactics And Rescue Service — Спецотряд по Тактическим и Спасательным Операциям) направлена для расследования громкой серии убийств, произошедших в Арклейских горах — пригороде Раккун-сити. По пути к месту расследования, у вертолёта, в котором летела команда полицейских, отказывает двигатель, и он падает в лес. К счастью, в крушении никто серьёзно не пострадал. Продолжив движение пешком, команда натыкается на перевёрнутый внедорожник военной полиции, в котором обнаруживаются тела двух офицеров со странными следами на телах. Согласно найденным документам, машина перевозила преступника, бывшего военного, виновного в убийствах, к месту казни. Далее команда решает разделиться, чтобы расширить район поисков. Фельдшер группы, Ребекка Чемберс набредает на остановившейся посреди леса поезд...

Ребекка обнаруживает, что остановившийся экспресс кишит заражёнными людьми — зомби. Пережив первый кошмар от встречи с ними, она находит выжившего человека — парня по имени Билли Коэн, бывшего морского пехотинца, которого перевозила найденная в лесу машина. Теперь Ребекка и Билли становятся одной командой и следуют дальше вместе, защищаясь от атакующих монстров: зомби, мутировавших собак, пиявок и огромного мутанта-скорпиона. Внезапно поезд начинает движение и набирает опасную скорость. Ребекка и Билли используют стоп-кран и покидают состав. Перед ними предстаёт заброшенный научно-исследовательский комплекс.

Двое персонажей обходят подземный комплекс, отражая атаки существ, появившихся в ходе экспериментов корпорации "Umbrella": мутировавших насекомых, пауков и приматов. В ходе прохождения, Коэн рассказывает о своём прошлом. Его отряд против собственной воли был отправлен на уничтожение неповинных гражданских лиц в африканской деревушке, в охваченной гражданской войной стране. Вскоре стало известно, что приказ уничтожить гражданских основывался на ложной информации, а значит, являлся преступным.

Затем Ребекка и Билли узнают, что бывший хозяин комплекса, Джеймс Маркус, при участии Озвелла Е. Спенсера и Эдварда Эшфорда сделали фундаментальное открытие — вирус-прародитель. Смешав открытый ими вирус с вирусом Эбола, они получили агент, способный вызывать немедленную мутацию заражённого организма. Единственным серьёзным недостатком вируса была крайне высокая светочувствительность, губительная для вируса. Изначально Эфшорд хотел применять открытый ими вирус в медицине, используя его мощные регенеративные свойства, но после его смерти Спенсер и Маркус принялись изучать возможности применения вируса в качестве биологического оружия. Скомбинировав вирус с ДНК пиявки, они получили Т-вирус, превращавший заражённых в зомби.

Одолев в решающем поединке гиганскую летучую мышь, Билли Коэн подвергается атаке заражённого Т-вирусом примата и пропадает в подземелье комплекса. Ребекка отправляется на его поиски, и встречает другого члена команды «Браво» — командира Энрико Марини. Вместе с Энрико они сражаются с освободившимся Тираном, а затем находится пропавший Билли.

Сразившись с Тираном, Билли и Ребекка встречают Маркуса. Он рассказывает им, что ни Альберт Вескер, ни Уильям Биркин не имеют никакого отношения к вырвавшемуся на свободу вирусу, который погубил железнодорожный экспресс и особняк в горах. Вся вина лежит на нём, Маркусе, работавшем на корпорацию "Umbrella" до того момента, пока его не убили Вескер и Биркин по приказу Спенсера. Умирая, Маркус внедрил в своё тело заражённую Королевскую пиявку, что позволило ему "воскреснуть" и сохранить память о своей прежней жизни. Теперь Маркус превратился в массу пиявок, которая принялась преследовать героев. Биркин активировал систему самоуничтожения, а Ребекка и Билли вступили в финальное сражение с Королевской Пиявкой. Одолеть монстра им помог яркий свет только что взошедшего солнца, чьи лучи упали через открытый сдвижной потолок лаборатории. Ребекка бросила Билли револьвер, а последний прикончил Королевскую Пиявку.

Комплекс взрывается, Ребекка и Билли выбегают на вершину скалы, откуда открывается вид на особняк Спенсера, в котором произойдут события первой части Resident Evil. Герои отдают друг другу воинску честь. Ребекка заявляет, что отныне Билли Коэн официально числится погибшим. Каждый идёт своей дорогой, Ребекка — по направлению к особняку, в надежде узнать о судьбе членов команды «Браво». Но это уже события первой части Resident Evil...

Ребекка Чемберс Самый молодой член команды «S.T.A.R.S. Bravo», медик, едва поступившая на службу.
Билли Коэн Осуждённый за военное преступление, которого не совершал, один из главных героев. Его перевозили на грузовике для осуществления смертной казни, но грузовик подвергся нападению и Билли бежал.
Альберт Вескер Капитан отделения «S.T.A.R.S.» в Ракун-Сити. На самом деле он двойной агент, работающий на корпорацию «Umbrella» и один из руководителей проекта по созданию смертоносного Т-вируса.
Уильям Биркин Один из создателей Т-вируса. Молодой учёный, он одержим своими экспериментами и готов ради их осуществления идти до конца.
Джеймс Маркус Один из создателей «Umbrella». Однажды его укусила инфицированная Т-вирусом пиявка и с тех пор Маркус имеет неограниченную власть над пиявками. Главный враг в игре.
Энрико Марини Командир «S.T.A.R.S. Bravo».
Эдвард Дьюи Пилот вертолёта команды «S.T.A.R.S. Bravo».

Действие игры разворачивается в 2004 году. Главный герой — Леон Скотт Кеннеди, бывший также главным героем «Resident Evil 2». В начале игры Леон напоминает о недавнем решении Президента США уничтожить город Раккун-Сити (Raccoon City) ядерной ракетой и рассказывает о последующем падении акций, банкротстве и исчезновении корпорации «Umbrella». С тех событий прошло 6 лет, Леон работает в Секретной Службе США, и получает задание спасти дочь президента — Эшли Грэхем — которая была похищена неизвестными лицами.

Леон прибывает в деревню, где предположительно скрылись похитители. В скором времени его атакуют местные жители, которые, судя по их поведению, несколько не в себе. По мере развития сюжета игрок узнает о паразитическом организме Лас Плагас (Las Plagas), ископаемые образцы которого были в шахтах, где работали жители деревни. Как оказалось, Лас Плагас выделяли споры, которые попадали в тела жителей и развивались там. Лас Плагас, как упоминается в игре, полностью управляют телом носителя и, вероятно, обладают коллективным разумом. Дальше распространение Лас Плагас подталкивалось местным аристократом Рамоном Салазаром, а также неким Озмундом Саддлером, организатором религиозной секты Лос Иллюминадос, пропагандистом идеи нового мира, который способен управлять паразитами в телах зараженных.

Позже в игре появляются персонажи из старых частей — Ада Вонг и Альберт Вескер, которые хотят захватить образец Лас Плагас с целью использования его для усовершенствования Т-вируса и восстановления «Umbrella». Но в конце выясняется, что Ада водит Вескера за нос, и передаёт паразита некой организации, которая поручила ей следить за Вескером и играть с ним в кошки-мышки, о чём говорит фраза, адресованная Вескеру вне связи: «Наверное, ты забыл, Вескер, — я не всегда играю по твоим правилам…». НО как выясняется в «Resident Evil 5» Вескер всё же смог завладеть образцом Лас Плагас.

Леон Скотт Кеннеди (Leon Scott Kennedy) — Главный герой игры. В прошлом - бывший офицер полиции Раккуна, который ответственен за уничтожение подземной лаборатории корпорации «Амбрелла» (события Resident Evil 2). После того инцидента Леон был завербован правительством США. В настоящее время он является секретным агентом на службе у президента.Главный герой игры Resident Evil 2
Эшли Грэм (Ashley Graham) — дочь президента США, похищенная религиозным культом Лос Иллюминадос по пути домой из колледжа.
Ингрид Ханниген (Ingrid Hunnigan) — сотрудник Секретной Службы США, помогает Леону в выполнении миссии.
Майк (Mike) — пилот военного вертолёта, посланного в поддержку Леону под конец игры.
Джек Краузер (Jack Krauser) — бывший напарник Леона, ныне работающий на Вескера, сильный опытный боец. Похитил Эшли для завоевания доверия Саддлера. В качестве играбельного персонажа появляется в режиме «Наёмники».
Эйда Вонг (Ada Wong) — персонаж Resident Evil 2, нанята Альбертом Вескером, но охотится за образцом Лас Плагас в своих собственных целях. Главный герой сценариев «Задание Эйды» и «Другие пути», доступных после прохождения основного сценария за Леона. В настоящее время, она является агентом какой-то секретной организации, а ее главные мотивы игроку еще предстоит выяснить.
Альберт Вескер (Albert Wesker) — бывший сотрудник корпорации Umbrella, использует Краузера и Аду Вонг для получения образца Лас Плагас. Доступен в режиме «Наёмники».
Ханк (Hunk) — наёмный боец корпорации Umbrella, персонаж Resident Evil 2, присутствующий и во 2-й, и в 4-й частях игры только в бонусном режиме «Наёмники» («Mercenaries»).
Луис Сера (Luis Sera) — Таинственный испанец, которого главный герой встречает по ходу выполнения миссии. Бывший мадридский полицейский, нанятый Озмундом Саддлером в качестве исследователя. Двойной агент, расследует деятельность секты Лос Иллюминадос. Помогает Аде Вонг получить образец Лас Плагас. Вместе с Леоном они пытаются выжить в ужасных событиях, которые творятся вокруг.Вскоре после появления,к сожалению погибает.
Биторес Мендез — Староста деревни, в которую прибывает Леон. Высокий и страшный на вид мужчина, который настроен крайне недоброжелательно к незваному гостю. Является одним из приближенных лорда Саддлера.
Рамон Салазар (Ramon Salazar) — местный аристократ, чьи предки когда-то запечатали Лас Плагас, поклонник Озмунда Саддлера.
Озмунд Саддлер (Osmund Saddler) — основатель секты Лос Иллюминадос, сторонник распространения Лас Плагас и создания с помощью паразитов нового «чистого» мира.
Продавец (Merchant) — неизвестный странник, Леон может купить\усовершенствовать у него оружие, а также продать найденные драгоценности. В основном появляется в местах сохранений. Неизвестно, как он умудряется опрежать главного героя и находиться в самых неожиданных местах.

Сюжет игры разворачивается в вымышленном автономном районе Западной Африки — Кижуджу (англ. Kijuju). После событий, описанных в предыдущих играх серии, корпорация Umbrella исчезла, но ситуация с биологическим оружием не изменилась в лучшую сторону. Для противодействия био-угрозе была созданна специальная команда, названная BSAA (Bioterrorism Security Assessment Alliance). Команда была основана из людей, повидавших ужасы Раккун-Сити (англ. Raccoon City), а также лучших из лучших агентов, таких как Шева Аломар.
Корпорация Tricell, основанная на руинах Амбреллы Альбертом Вескером, является одним из крупнейших транснациональных консорциумов на рынке фармацевтических продуктов. Но это лишь прикрытие настоящей деятельности корпорации — разработки и производства биоорганического оружия.
Альберт Вескер получил образцы микроорганизмов Лас-Плагас (англ. Las Plagas), на основе которых строится сюжет Resident Evil 4, и объеденив их с ранней разработкой корпорации Амбрелла — вирусом «Прародитель», создал новейший вирус «Уроборос» (англ. Uroboros). С его помощью, Вескер хочет уничтожить человечество, превратив людей в послушных рабов. Наша задача — помешать ему в этом.

Крис Рэдфилд (Chris Redfield)(Владимир Вихров) — Крис является одним из главных героев. Также был главным героем в Resident Evil, Resident Evil Code: Veronica, а также появлялся в обеих частях Хроник. Крис входил в команду S.T.A.R.S., группы Альфа, которая была отправлена на поиски группы Браво. Крис исследует особняк Спенсера и узнает правду о Вескере, бывшем члене S.T.A.R.S., который предал их, чтобы испытать возможности мутировавших монстров. Но Крис и Джилл спасаются. Крис возвращается в Resident Evil: Code Veronica, пытаясь спасти свою сестру, Клэр Редфилд, которая пыталась уничтожить тяжело укреплённую базу Umbrella на острове Рокфорт и была схвачена. Крис планирует вырвать сестру из рук Альберта Вескера и, наконец, встретиться лицом к лицу с предателем, но бой прерывает взрыв. Оба спасаются, но Крис не может простить Вескеру предательство и жаждет уничтожить его и его нанимателей, корпорацию Umbrella. Прошло 10 лет после инцидента в Раккун-Сити. Крис вступает в BSAA, команду, борющуюся с биотеррористическими угрозами. Его новая миссия заносит его и его напарницу Шеву Аломар в район Киджуджу в Африке, где они обнаруживают, что жители заражены таинственной болезнью. Resident Evil 5 обещает рассказать, что произошло с остальными членами S.T.A.R.S., если учесть что прошло уже много времени.
Шева Аломар (Sheva Alomar) — напарница Криса. Является членом BSAA в Западной Африке. Судьба Шевы трагична и полна загадок. Родители Шевы погибают на одной из фабрик Амбреллы при испытании биологического оружия сразу после этого Амбрелла уничтожают деревню в которой жила Шева .Потом Шева жила у дальних родственников, переезд сначала в США, а затем в Европу… Всё это негативно влияет на Шеву. Понимая, что в гибели родителей как-то замешана TriCell, Шева вступает в команду. Есть несколько отличий между Крисом и Шевой. Шева более подвижна и использует своё преимущество на поле боя. К тому же она левша и способна добраться до тех мест, куда Крис не может.
Рикардо Ирвин (Ricardo Irving) — агент TriCell, который продавал биологическое оружие террористам. Имеет большую страсть к деньгам. Преследуем главными героями до середины игры, когда вкалывает себе вирус и мутирует, но Крис и Шева его побеждают.
Альберт Вескер (Albert Wesker) (Владимир Антоник) — главный злодей пятой части, а по совместительству и всей серии Resident Evil. После крушения Амбреллы, Вескер переметнулся к могущественной корпорации Tricell. Вескер, который давно имеет зуб на весь род людской решает окончательно истребить человечество путем уничтожения самолёта с вирусом на борту. Вескер давно перестал быть человеком. Теперь он — сверхсоздание, обладающее молниеносной реакцией, силой и другими способностями, которые человеку не подвластны. В процессе игры выясняется что именно он убил Озвелла Спенсера, основателя Амбреллы, после того как тот рассказал Вескеру что он был частью эксперимента Спенсера по созданию сверхлюдей, в результате которого Спенсер собирался стать богом нового вида людей. Вескер ,понимая что Спенсер его использовал, приходит в ярость и со словами "Право быть богом-теперь это мое право…"пробивает тело Спенсера рукой насквозь. В игре довольно часто появляется в роликах. В финале игры улетает на бомбардировщике с целью распылить Уроборос и по его словам стать «Творцом». Но после схватки с Крисом самолет падает в жерло вулкана и начинается финальная битва Криса и Шевы с Вескером, в результате которой он падает в лаву и погибает (хотя есть вероятность что он выжил).
Экселла Жионне (Excella Gionne) — глава Африканского отдела компании Триселл и ассистентка Вескера. Между ними существует скрытая страсть. Использовала свои ресурсы и финансы для создания вируса Уроборос, с помощью которого Вескер собирался фактически подчинить мир себе. Экселла также надеялась на свою долю власти. Но ближе к концу игры Вескер заражает её вирусом Уроборос, и она мутирует. Сам Вескер говорит по этому поводу Крису: «Уроборос не принял её…»
Джилл Валентайн (Jill Valentine) — один из старейших персонажей серии. После того, как она, спасая жизнь Крису Рэдфилду, выпрыгнула из окна вместе с Альбертом Вескером в особняке Спенсера, все считали, что девушка погибла (хотя тело Джилл не было обнаружено). До середины игры мы ничего не узнаем о её судьбе, лишь потом, под занавес, нам расскажут, что произошло с Джилл на самом деле. Джилл Валентайн — главная героиня сценариев Lost In Nightmares и Desperate Escape.
Личность в капюшоне — персонаж, о котором ничего не известно кроме того, что он помогает Экселле. Ближе к финалу игроку открывается истинная личность этого персонажа.
Капитан Джош Стоун (Josh Stone) — командир группы Дельта. Учитель Шевы. Отлично разбирается в технике. После гибели своего отряда, выступал в качестве рулевого в лодке. В финальном ролике спасает Криса и Шеву на вертолёте. Является главным героем сценария Desperate Escape, в котором он вместе с Джилл Валентайн пытается выбраться с фабрики Tricell в доках.
Информатор BSAA Рейнард Фишер (Reynard Fisher) — бывший местный мясник, выдающий в начале игры снаряжение Крису и Шеве. Вскоре погибает — ему отрубает голову палач.